短鎖脂肪に対して特異性の高いリパーゼおよびその使用

专利摘要:
本発明は、新しい脂肪分解酵素をコードする遺伝子を含んでなる新しいポリヌクレオチド配列、ならびにそれと高い相同性がある遺伝子またはアミノ酸配列の機能的同等物に関する。本発明はまた、例えば乳製品またはベーキング産業などの産業工程において、これらの脂肪分解酵素を使用する方法にも関する。
公开号:JP2011512809A
申请号:JP2010548109
申请日:2009-02-26
公开日:2011-04-28
发明作者:ユリア；エム． エフィモファ，；マルホット；エリザベート；フランソワ スーネフェルト−ベルフマンス，；アルイェン セイン，；ファン，；アルベルトゥス；アラール ダイク，；アリエ；ヘリット テルドゥ，；カリン トゥルク，；ファン；デル，；ヤン；メスケ ラーン，
申请人:ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 本発明は、新しい脂肪分解酵素をコードする遺伝子を含んでなる、新たに同定されたポリヌクレオチド配列に関する。本発明は新しい遺伝子の全長コード配列、ならびに全長機能的タンパク質のアミノ酸配列、および遺伝子またはアミノ酸配列の機能的同等物を特徴とする。本発明はまた、産業工程において、例えば乳業などの食品産業において、これらのタンパク質を使用する方法に関する。本発明にはまた、これらのタンパク質および細胞を生成するのに適した、本発明に従ったポリヌクレオチドで形質転換された細胞も含まれる。]
背景技術

[0002] リパーゼは脂質基質中のエステル結合の加水分解を触媒する酵素であり、脂肪酸の放出をもたらす。リパーゼは乳業用途で風味生成のために、最も重要なことにはチーズで使用される。伝統的にヤギ、仔ヤギ、仔ウシまたは仔羊に由来する反芻動物リパーゼ製剤が使用される。これらはこれらの反芻動物からの前胃組織に由来し、これらのリパーゼ製剤はまた、前胃エステラーゼとも称される。オランダ国（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＤＳＭＦｏｏｄ ＳｐｅｃｉａｌｔｉｅｓからのＰｉｃｃａｎｔａｓｅ（登録商標）Ｃ、Ｌ、ＫＧ、およびＫなどの市販製剤が販売されている。これらのリパーゼは、多様なイタリア、スペイン、ギリシア、およびフランスチーズの調製において使用される。これらのタイプのチーズにおける熟成中の特定の風味プロフィールの生成は、乳脂肪に対するリパーゼの作用が主因である。リパーゼは、遊離脂肪酸の発生と共に乳脂肪の加水分解を触媒する。前記脂肪酸は、短鎖（４または６個の炭素原子を含有するＣ４〜Ｃ６脂肪酸、すなわち酪酸、カプロン酸）および中鎖から長鎖（Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸）を有してもよい。引き続いて遊離脂肪酸は、例えばアセトアセテート、β−ケト酸、メチルケトン、エステル、およびラクトンなどの風味化合物の形成などの化学反応に関与することができる。風味構成要素中の脂肪酸の転換は、チーズ中の微生物個体群起源の酵素によって触媒できる。]
[0003] チーズ中においてリパーゼによって放出される遊離脂肪酸のタイプは、使用されるリパーゼタイプの影響を受けることが知られている。例えば主として短鎖脂肪酸（例えばＣ４およびＣ６を含有する脂肪酸）を放出するリパーゼが、ぴりっと辛くシャープでスパイシーなツーンとする風味の発生をもたらす一方、中鎖から長鎖脂肪酸の放出は石鹸のような味をもたらし得る。リパーゼの使用は、酵素処理チーズ（ＥＭＣ；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら，「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」より（２００３年；Ｆｏｘら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）４３４〜４３８頁）またはバター脂肪およびクリームの加水分解、およびそれらの応用（Ｋｉｌａｒａ，「Ｅｎｚｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」より（２００３年；Ｆｏｘら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）９１４〜９１８頁）などのチーズ以外の乳業用途において増大している。]
[0004] 反芻動物リパーゼは、乳脂肪から短鎖脂肪酸（Ｃ４、Ｃ６含有脂肪酸）を放出するそれらの特異性のために、微生物リパーゼよりも好ましい。これらの化合物は、それ自体が風味化合物であり、あるいは特有の風味効果がある揮発性エステルに転換する（（Ｌｉｕら，Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ Ｊ．２００４年，１４，９２３〜９４５頁）。興味深い課題は反芻動物リパーゼの組成物であり、それはいくつかの論文の主題である（例えばＡｄｄｉｓら，Ｉｎｔ．ｄａｉｒｙ Ｊ．（２００５年）１５，１２７１〜１２７８頁；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．（１９６７年）５０，１０６１〜１０６５頁；Ａｄｄｉｄら，Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ Ｊ．（２００５年）１５，５６３〜５６９頁；Ｈａｍｏｓｈ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（１９９０年）６，４２１〜４２８頁；Ｃａｌｖｏら（２００４年）Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８７，１１３２〜１１４２頁）。提示されたデータからは、ほとんどの反芻動物酵素が恐らくは２つ以上リパーゼの混合物であり、生じる組成の多様性がチーズ風味形成における性能の変化につながるという結論がもたらされる。この多様性が、均一性の改善された代替え酵素源を産業界が探し求める推進力になっている。スクレピーおよび狂牛病などの動物疾患の発生は、産業界が代替え物を探し求める別の推進力である。さらなる支持は、コーシャおよびハラール品質の製品への容易なアクセスに対する要求に由来する。したがって動物由来リパーゼの代替え物に対する強い産業的要求がある。]
[0005] 米国特許出願公開第２００４／０００１８１９号明細書は、酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）中での仔ヤギ前胃エステラーゼのクローニングおよび発現について記載している。潜在的に興味深いものではありながら、酵素の生成は不良であり、さらに遊離脂肪酸放出プロフィールは、元の仔ヤギエステラーゼと比較してより長い鎖長の脂肪酸にシフトした。これらの２つの側面は、経済性の不良と用途における性能欠如のために、この酵素を魅力的でなくする。好ましい代替え物は、微生物リパーゼ、または微小生物によって組み換え的に産生される（微生物）リパーゼであろう。いくつかの微生物リパーゼが販売されている（例えばＢｊｕｒｌｉｎら，ＪＡＯＣＳ（２００１年）７８，１５３〜１６０頁を参照されたい）。チーズ用途のための微生物リパーゼの最も重要な特徴は、それらの乳脂肪からの脂肪酸放出プロフィールであり、それは動物由来リパーゼを可能な限り近く模倣しなくてはならない。しかし微生物リパーゼは、短鎖脂肪酸（Ｃ４、Ｃ６）と比較して、長鎖（Ｃ１２〜Ｃ１８）脂肪酸の放出に対する選択性を有することから、この点において機能が劣る。これは所望されるぴりっと辛い風味でなく、石鹸のような味の生成をもたらすことが多い。したがって相当数の市販微生物リパーゼ製剤が販売されているという事実にもかかわらず、反芻動物前胃リパーゼなどの動物由来リパーゼに取って代ることができる、非動物由来リパーゼに対する工業的必要が依然としてある。]
図面の簡単な説明

[0006] パルメザンチーズのＦＦＡプロフィールと比較した、チェダーチーズペースト中で脂肪分解酵素Ｌ０１、Ｌ０３、Ｌ０４によって、およびリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）からの市販の微生物リパーゼ（Ｐｉｃｃａｎｔａｓｅ（登録商標）Ｒ８０００）によって発生したＦＦＡプロフィールである。]
[0007] ［発明の目的］
本発明の目的は、乳業において、より詳しくはチーズまたはチーズ様製品の製造において、バター脂肪またはクリームの脂肪分解において、または酵素処理チーズの製造において使用するのに適した、新しい脂肪分解酵素を提供することである。さらに新しい脂肪分解酵素をコードする新しいポリヌクレオチドを提供することが、本発明の目的である。さらなる目的は、組み換え的に生成された脂肪分解酵素、ならびにこれらを産生する組み換え株を提供することである。また融合ポリペプチドも本発明の一部であり、ならびに本発明に従ったポリヌクレオチドおよびポリペプチドを生成して使用する方法も本発明の一部である。]
[0008] ［発明の概要］
本発明は、乳業で使用するのに適した新しい脂肪分解酵素を提供する。意外にも新しい脂肪分解酵素は、脂質含有食品成分、好ましくはチーズの酵素修飾による風味生成で使用するのに極めて適する。新しい脂肪分解酵素はまた、有利にはチーズ熟成において、チーズ様製品の製造において、クリームまたはバター脂肪改質においても使用できる。さらに酵素は、適切にはベーカリー製品の製造などのその他の食品用途においても使用できる。]
[0009] 本発明は、新しい脂肪分解酵素をコードする新しいポリヌクレオチドをさらに提供する。]
[0010] 本発明に従ったポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物、
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同的である、ヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の成熟ポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であり、前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７である、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コードの縮重の結果として縮重する配列、
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。]
[0011] 特に本発明は、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同的である、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。したがって本発明は、配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、なおもより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％相同的なポリヌクレオチドを提供する。]
[0012] 一実施態様ではこのような単離されたポリヌクレオチドは、例えば固相合成によって、または当業者に既知のその他の方法によって合成的に得ることができる。]
[0013] 別の実施態様では本発明は、配列番号１に記載の脂肪分解酵素遺伝子、または依然として活性酵素をコードする機能的同等物を提供する。]
[0014] 好ましくは本発明に従ったポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列である。]
[0015] 本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターに関し、本発明に従ったＤＮＡを増幅または検出するのに使用されてもよいプライマー、プローブ、および断片に関する。]
[0016] さらなる好ましい実施態様では、本発明に従ったポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの制御配列と作動的に連結して、適切な宿主細胞中でのポリヌクレオチド配列の発現を可能にする、ベクターが提供される。好ましくは前記適切な宿主細胞は糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種である。適切な株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）に属する。好ましくは、宿主細胞はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である。]
[0017] 本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチドを含有する、組換え的に生成された宿主細胞に関する。]
[0018] 本発明はまた、本発明に従ったポリヌクレオチドおよびベクターを調製する方法も提供する。]
[0019] 別の実施態様では、本発明は、本発明に従ったポリヌクレオチドの発現が顕著に増大され、または脂肪分解活性の生成レベルが顕著に改善される、組み換え宿主細胞を提供する。]
[0020] 別の実施態様では、本発明は、本発明に従った異種または相同ＤＮＡを含有する組み換え的に生成される宿主細胞を提供し、細胞は本発明に従った機能性脂肪分解酵素を産生でき、すなわちそれは例えば本発明に従った遺伝子のコピー数が増大しているアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株のように、本発明に従った脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチドを発現、または好ましくは過剰発現できる。]
[0021] 本発明のさらに別の態様では、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドが提供される。本発明に従ったポリペプチドは、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物、
（ｂ）前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７である、配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であるポリペプチド、
（ｃ）本発明に従ったポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。好ましくは本発明に従ったポリペプチドは、少なくとも０．７、好ましくは、少なくとも０．８、０．９、１．０、１．１、１．５、１．７、２、２．５、３である、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃを有する。]
[0022] 一実施態様では本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であり、前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７、好ましくは少なくとも０．８、０．９、１．０、１．１、１．５、１．７、２、２．５、３である、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドに関する。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドに関する。Ｒｓｐｅｃについては、本明細書中で後からさらに詳しく定義する。]
[0023] 本発明に従ったポリペプチドを含んでなる融合タンパク質もまた、本発明の範囲内である。本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドを作成する方法も提供する。]
[0024] 本発明はまた、本明細書で記載されているようなあらゆる産業工程における、より具体的には食品産業における、例えば乳業またはベーカリー産業における、本発明に従った脂肪分解酵素の使用に関する。]
[0025] ［発明の詳細な説明］
［ポリヌクレオチド］
本発明は第１の態様において、
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物、
（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同的である、ヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の成熟ポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であり、前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７である、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コードの縮重の結果として縮重する配列、
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。]
[0026] 一実施態様では、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに対応するアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する機能的同等物を有する脂肪分解酵素をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。]
[0027] 本発明の文脈で「成熟ポリペプチド」とは、本明細書で翻訳、およびＮ末端プロセシング、Ｃ末端トランケーション、グリコシル化、ホスホリル化などのあらゆる翻訳後修飾に続いて、最終形態にある脂肪分解活性を有するポリペプチドと定義される。成熟過程は、特定の使用発現ベクター、発現宿主、および製造工程に左右されるかもしれない。好ましくは、成熟ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸３４〜３０４である。「成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」とは、本明細書で成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と定義される。好ましくは成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１中のヌクレオチド１００〜９１２である。]
[0028] 別の実施態様では本発明は、配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であり、前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７、好ましくは少なくとも０．８、０．９、１．０、１．１、１．５、１．７、２、２．５、３である、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドに関する。Ｒｓｐｅｃについては、明細書中で後からさらに詳しく定義する。]
[0029] 本発明は、脂肪分解酵素をコードする遺伝子を含んでなるポリヌクレオチド配列、ならびにそのコード配列を提供する。したがって本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物などの変異型を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドに関する。]
[0030] 特に本発明は、好ましくはストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの補体とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドに関し、好ましくは前記配列は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同的である。]
[0031] より具体的には本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでなり、または本質的にそれからなる単離されたポリヌクレオチドに関する。]
[0032] このような単離されたポリヌクレオチドは、当業者に既知の方法を用いた合成によって得られてもよい。]
[0033] 本明細書での用法では、「遺伝子」および「組み換え遺伝子」という用語は、例えば脂肪分解酵素などのタンパク質をコードする読み取り枠を含む、染色体ＤＮＡから単離されてもよい核酸分子を指す。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロン、および制御配列を含んでもよい。さらに遺伝子は、本明細書で定義されるような単離された核酸分子またはポリヌクレオチドを指す。]
[0034] 配列番号１のヌクレオチド配列またはその機能的同等物を有する核酸分子などの本発明の核酸分子は、標準分子生物学技術および本明細書で提供される配列情報を使用して単離できる。例えばハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１の核酸配列の全部または一部を使用して、本発明に従った核酸分子を標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離できる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年に記載されるように）。]
[0035] さらに配列番号１の全部または一部を包含する核酸分子は、配列番号１に含有される配列情報に基づいてデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離できる。]
[0036] 本発明の核酸は、標準ＰＣＲ増幅技術に従って、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは代案としてはゲノムＤＮＡをテンプレートとして、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅できる。このように増幅された核酸を適切なベクターにクローンし、ＤＮＡ配列分析によって特性決定できる。]
[0037] さらに本発明に従ったヌクレオチド配列の補体に対応するまたはハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチドが、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用して、標準合成技術によって調製できる。]
[0038] 好ましい実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでなる。配列番号１の配列は、配列番号２に記載のポリペプチド、および配列番号２中の成熟ポリペプチドに一致する脂肪分解酵素をコードする。配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに一致する一致する脂肪分解酵素は、Ｌ０１で示される。配列番号１に記載のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ Ｌ０１で示される。]
[0039] 別の好ましい実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列の機能的同等物の補体である、核酸分子を含んでなる。]
[0040] もう１つのヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、その他のヌクレオチド配列と十分に相補的なものであるので、それはもう１つのヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それによって安定した二本鎖を形成できる。]
[0041] 本発明の一態様は、本発明のポリペプチド、または例えば生物学的に活性な断片またはドメインなどのその機能的同等物などの変異型をコードする単離された核酸分子、ならびに本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子、および核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するのに適したこのような核酸分子の断片に関する。]
[0042] 「単離されたポリヌクレオチド」または「単離された核酸」とは、それが由来する生物の天然ゲノム中で、（５’末端に１つおよび３’末端に１つある）それが隣接するコード配列のどちらにも隣接しないＤＮＡまたはＲＮＡである。したがって一実施態様では、単離された核酸は、コード配列に隣接する５’非コード（例えばプロモーター）配列のいくつかまたは全てを含む。したがって用語は、例えばベクター、自己複製プラスミドまたはウィルス、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれ、またはその他の配列から独立した離隔分子として存在する組み換えＤＮＡ（例えばＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）を含む。それはまた、追加的ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡを含み、細胞物質、ウィルス性物質、または培地（組み換えＤＮＡ技術によって生成される場合）、または化学前駆物質またはその他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない。さらに「単離された核酸断片」は、断片として自然発生せず自然状態では見られない核酸断片である。]
[0043] 本明細書での用法では、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、およびヌクレオチド類似体を使用して作り出されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことが意図される。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることができるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸はオリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成されてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば改変された塩基対合能力またはヌクレアーゼに対する増大した抵抗性を有する核酸を調製するのに使用できる。]
[0044] 本発明の別の実施態様は、例えば本発明に従った核酸分子のコード鎖などの本発明に従った核酸分子のアンチセンスである、単離された核酸分子を提供する。]
[0045] 本発明に従ったポリヌクレオチドの補体ストランドもまた、本発明の範囲内に含まれる。]
[0046] ［核酸断片、プローブ、およびプライマー］
本発明に従った核酸分子は、例えばプローブまたはプライマーとして使用できる断片、または本発明に従ったタンパク質の一部をコードする断片などの、配列番号１に記載の核酸配列の一部または断片のみを含んでなってもよい。本発明に従ったヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のタンパク質と少なくとも９０％の相同性を有する、本発明に従ったタンパク質の機能的同等物の同定および／またはクローニングで使用するためにデザインされた、プローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、少なくとも約１２または１５、好ましくは約１８または２０、好ましくは約２２または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７５個以上の本発明に従ったヌクレオチド配列の連続的ヌクレオチドとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を典型的に含んでなる、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含んでなる。]
[0047] 本発明に従ったヌクレオチドに基づく、より好ましくは配列番号１に基づく配列プローブは、例えば生物中で同一または相同的タンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するのに使用できる。好ましい実施態様では、プローブはそれに付着する標識群をさらに含んでなり、例えば標識群は放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、または酵素補助因子であることができる。このようなプローブはまた、本発明に従ったタンパク質を発現する細胞を同定するための診断用試験キットの一部として使用できる。]
[0048] ［同一性および相同性］
「相同性」または「％同一性」という用語は、本明細書で同義的に使用される。本発明の目的では、それは本明細書で２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％相同性を判定するために、配列を最適比較目的でアラインすることと定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップを導入してもよい。このようなアラインメントは、比較される配列の全長にわたり実施できる。代案としては、アラインメントは、例えば約２０、約５０、約１００個以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたるより短い長さにわたって実施されてもよい。同一性は、報告された整列領域にわたる２配列間の完全一致の百分率である。]
[0049] ２配列間の配列比較および％同一性判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。当業者には、２つの配列をアラインして２配列間の相同性を判定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用できるという事実は既知である（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３年）「Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」，Ｄ．ＳａｎｋｏｆｆおよびＪ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ（編），「Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」より，１〜４４頁，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３〜４５３頁）を使用して判定されてもよい。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列のどちらもアルゴリズムによってアラインできる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０またはそれ以降、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００年）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）２７６〜２７７頁，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列のためには、置換マトリックスのためのＥＢＬＯＳＵＭ６２を使用する。ヌクレオチド配列のためには、ＥＤＮＡＦＵＬＬを使用する。使用する任意のパラメーターはギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ−ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）１０、およびギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）０．５である。当業者は、これらの全ての異なるパラメーターがわずかに異なる結果を生じるが、異なるアルゴリズムを使用した場合、２つの配列の総体的百分率同一性は顕著に変わらないことを理解するであろう。]
[0050] 上述のようなプログラムＮＥＥＤＬＥによるアラインメントの後に、クエリー配列と本発明の配列間の同一性百分率が次のように計算される。双方の配列中の同一アミノ酸または同一ヌクレオチドを示すアラインメント中の対応位置数からアラインメント中のｇａｐ総数を差し引いて、アラインメントの全長で割る。同一性は、本明細書でＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用してＮＥＥＤＬＥから得ることができると定義され、プログラムの結果中に「最長同一性」として標識される。]
[0051] 本発明の核酸およびタンパク質配列を「クエリー配列」としてさらに使用して公共データベースに対する検索を実施し、例えばその他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定できる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ＝１２により実施して、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ＝３により実施して、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップドアラインメントを得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２頁で記載されているように、ギャップドＢＬＡＳＴを使用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用できる。国立バイオテクノロジー情報センターのホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい。]
[0052] ［ハイブリダイゼーション］
本明細書での用法では、「ハイブリッド形成」という用語は、その下で互いに少なくとも約６０％、６５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９８％相同的なヌクレオチド配列が、典型的に互いの補体にハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件について記述することが意図される。]
[0053] このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的例は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション後、５０℃、好ましくは５５℃、好ましくは６０℃、なおもより好ましくは６５℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。]
[0054] 高度にストリンジェントな条件としては、例えば６８℃で５×ＳＳＣ／５×デンハルト液／１．０％ＳＤＳ中でのハイブリッド形成、そして室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄が挙げられる。代案としては、洗浄を４２℃で実施してもよい。]
[0055] 当業者は、ストリンジェントなおよび高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に、いずれの条件を適用するかを理解するであろう。このような条件に関する追加的ガイダンスは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編），１９９５年，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）など、当該技術分野で容易に入手できる。]
[0056] ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）、またはＴ（またはＵ）残基の相補的ストレッチのみとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、あらゆるポリ（Ａ）ストレッチまたはその補体（例えば事実上あらゆる二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する核酸分子とハイブリダイズすることから、もちろん本発明の核酸の一部と特異的にハイブリダイズするのに使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。]
[0057] ［その他の生物から全長ＤＮＡを得る］
典型的なアプローチでは、例えば糸状菌などのその他の生物から、特にフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種から構築されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーンできる。]
[0058] 例えばフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株をノーザンブロット法分析によって、配列番号１と相同的なポリヌクレオチドについてスクリーンできる。本発明に従ったポリヌクレオチドと相同的な転写物を検出したら、当業者に良く知られている標準技術を使用して、適切な株から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築できる。代案としては、本発明に従ったポリヌクレオチドとハイブリッド形成できるプローブを使用して、全ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーンできる。]
[0059] 相同的な遺伝子配列は、例えば本明細書で教示されるヌクレオチド配列に基づいてデザインされた２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを使用して、ＰＣＲを実施することで単離できる。]
[0060] 反応のためのテンプレートは、本発明に従ったポリヌクレオチドを発現することが知られている、または疑われる株から調製されるｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであることができる。ＰＣＲ産物はサブクローンおよび配列決定して、増幅された配列が本発明に従った新しい核酸配列、またはその機能的同等物の配列に相当することを保証できる。]
[0061] 次にＰＣＲ断片を使用して、多様な既知の方法によって全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。例えば増幅された断片を標識して使用し、バクテリオファージまたはコスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリーンできる。代案としては標識断片を使用して、ゲノムライブラリーをスクリーンできる。]
[0062] ＰＣＲ技術はまた、その他の生物から全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに使用できる。例えば標準操作手順に従って、適切な細胞原料または組織原料からＲＮＡを単離できる。逆転写反応は、第一鎖合成のプライミングのために増幅された断片のほとんどの５’末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＮＡ上で実施できる。]
[0063] 次に標準末端基転移酵素反応を使用して、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを（例えばグアニンで）「テール形成（ｔａｉｌｅｄ）」でき、ハイブリッドをＲＮａｓｅＨで消化でき、次に（例えばポリ−Ｃプライマーで）第二鎖合成をプライムできる。したがって増幅された断片上流のｃＤＮＡ配列を容易に単離できる。有用なクローニング戦略のレビューについては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出；およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい。]
[0064] ［ベクター］
本発明の別の態様は、脂肪分解活性を有するポリペプチドをコードする本発明に従ったポリヌクレオチド配列または本発明に従ったその機能的同等物を含んでなる、クローニングおよび発現ベクターをはじめとするベクターに関する。本発明はまた、このようなベクターを生育させ、例えば本発明のポリペプチド発現が起きる条件下で、適切な宿主細胞に形質転換または形質移入する方法に関する。本明細書での用法では「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。]
[0065] 本発明のポリヌクレオチドは、組み換え複製可能なベクター、例えばクローニングまたは発現ベクターに組み込むことができる。ベクターは、適合性宿主細胞中で核酸を複製するのに使用してもよい。したがってさらなる実施態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入して、ベクターを適合性宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を生育させることで、本発明のポリヌクレオチドを作成する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。適切な宿主細胞については下で述べる。]
[0066] その中に発現カセットまたは本発明のポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、好都合には組み換えＤＮＡ手順が施されてもよいあらゆるベクターであってもよく、ベクターの選択は、その中にそれが導入される宿主細胞に左右されることが多い。]
[0067] 本発明に従ったベクターは、例えばプラスミドのような自己複製ベクター、すなわち染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製と無関係であるベクターであってもよい。代案としてはベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに一体化されて、それが一体化された染色体と共に複製されるものであってもよい。]
[0068] １つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、それは追加的ＤＮＡセグメントをその中にライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウィルス性ゲノム中に追加的ＤＮＡセグメントをライゲートできるウィルスベクターである。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律複製できる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに一体化され、したがって宿主ゲノムと共に複製される。さらに特定のベクターは、それらが作動可能なように結合する遺伝子の発現を誘導できる。このようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。一般に組み換えＤＮＡ技術中で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドが通常使用されるベクターの形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書で同義的に使用できる。しかし本発明は、同等機能を果たすコスミド、ウィルスベクター（例えば複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウィルス）およびファージベクターなどのその他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。]
[0069] 本発明に従ったベクターは、例えばＲＮＡの生成のために生体外で使用してもよく、または宿主細胞を形質移入または形質転換するために使用してもよい。]
[0070] 本発明のベクターは、例えば過剰発現のために、例えば３、４または５個など、２個以上の本発明のポリヌクレオチドを含んでなってもよい。]
[0071] 本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含んでなり、それは組み換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列と作動的に連結する、１つ以上の制御配列を含むことを意味する。]
[0072] 組み換え発現ベクターにおいて、「作動的に連結する」とは、（例えば生体外転写／翻訳系中でまたは宿主細胞中で、ベクターが宿主細胞に導入される際に）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、関心のあるヌクレオチド配列が制御配列に結合していることを意味することが意図され、すなわち「作動的に連結する」と言う用語は、記載されている構成要素が、それらの意図される様式でそれらが機能できるようにする関係にある並置を指す。コード配列に「作動的に連結する」プロモーター、エンハンサー、またはその他の発現調節シグナルなどの制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような様式で配置され、または配列は、それらの意図される目的のためにそれらが協力して機能するように配置され、例えば転写はプロモーターで開始され、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を通じて進行する。]
[0073] 「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような制御配列については、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０年）で記載されている。]
[0074] 制御配列という用語は、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的な発現を誘導する配列、および特定の宿主細胞中のみでヌクレオチド配列の発現を誘導する配列（例えば組織特異的制御配列）を含む。]
[0075] したがって所定の宿主細胞のベクターまたは発現コンストラクトは、第１の発明のポリペプチドをコードする配列のコード鎖に対して、５’末端から３’末端に連続した順序で互いに作動的に連結する次の要素を含んでなってもよい。（１）所定の宿主細胞中でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列転写を誘導できるプロモーター配列、（２）任意に、所定の宿主細胞から培地へのポリペプチドの分泌を誘導できるシグナル配列、（３）本発明に従った脂肪分解活性を有するポリペプチドの成熟および好ましくは活性形態をコードする本発明のＤＮＡ配列、および好ましくはまた、（４）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流の転写を終結できる転写終結領域（ターミネーター）。]
[0076] 本発明に従ったヌクレオチド配列の下流には、１つ以上の転写終結部位（例えばターミネーター）を含有する３’非翻訳領域があってもよい。ターミネーターの起源は、それほど重要でない。ターミネーターは、例えばポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に天然であることができる。しかし好ましくは酵母宿主細胞中では酵母ターミネーターが使用され、糸状菌宿主細胞中では糸状菌ターミネーターが使用される。より好ましくは、ターミネーターは、（ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現される）宿主細胞に内在性である。転写された領域中では、翻訳のためのリボソーム結合部位が存在してもよい。コンストラクトによって発現される成熟転写物のコーディング部分は、先頭に翻訳開始ＡＵＧ、および翻訳されるポリペプチドの終端に適切に配置された終止コドンを含む。]
[0077] 本発明のポリヌクレオチドの増強された発現はまた、例えば発現、そして所望ならば発現宿主からの関心のあるタンパク質分泌レベルを増大させ、および／または本発明のポリペプチドの発現の誘導性制御を提供する役割を果たしてもよい、プロモーター、分泌リーダーおよび／またはターミネーター領域などの異種の調節領域の選択によって達成されてもよい。]
[0078] 当業者によって発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に左右されてもよいことが理解されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって本明細書で記載されているように核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（例えば脂肪分解活性を有する本発明に従ったポリペプチド、ポリペプチドの変異形態、その断片、変異型または機能的同等物、融合タンパク質など）を生成できる。]
[0079] 本発明の組み換え発現ベクターは、原核生物または真核細胞中での本発明に従ったポリペプチドの発現のためにデザインできる。例えば本発明に従ったポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および桿菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクターを使用して）、真菌細胞、酵母細胞または哺乳類細胞中で生成できる。適切な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０年）でさらに論じられている。代案としては、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、組み換え発現ベクターを生体外で転写および翻訳できる。]
[0080] ほとんどの糸状菌および酵母では、ベクターまたは発現コンストラクトは、安定した形質転換体を得るために好ましくは宿主細胞のゲノムに一体化される。しかし特定の酵母ではまた、安定した高レベル発現のために、その中に発現コンストラクトを組み込める適切なエピソームのベクターが利用でき、その例としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の２μおよびｐＫＤ１プラスミドにそれぞれ由来するベクター、またはＡＭＡ配列を含有するベクター（例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのＡＭＡ１）が挙げられる。発現コンストラクトが宿主細胞ゲノムに一体化される場合、コンストラクトは相同的組換えを使用して、ゲノム中のランダム遺伝子座、または所定の標的遺伝子座のどちらかで一体化され、その場合標的遺伝子座は好ましくは高度に発現される遺伝子を含んでなる。]
[0081] したがって本発明で有用な発現ベクターとしては、例えば細菌プラスミド；バクテリオファージ；酵母エピソーム；酵母染色体要素；バキュロウィルス、パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、およびレトロウィルスなどのウィルスに由来するベクターなどの染色体由来、エピソーム由来、およびウィルス由来ベクター、およびコスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝的要素に由来するものなどのそれらの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。]
[0082] ヌクレオチド挿入断片は、適切なプロモーターに作動可能なように結合すべきである。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に天然であるプロモーター以外に、その他のプロモーターを使用して、本発明のポリペプチドの発現を誘導してもよい。プロモーターは、所望の発現宿主中で本発明のポリペプチドの発現を誘導するその効率について選択されてもよい。本発明で有用かもしれないプロモーターの２、３の例としては、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０ｅａｒｌｙおよびｌａｔｅプロモーター、およびレトロウィルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。その他の適切なプロモーターが当業者に知られている。特定の実施態様では、真菌または酵母中において、本発明に従ったポリペプチドの高度な発現レベルを誘導できるプロモーターが好ましい。このようなプロモーターは、当該技術分野で知られている。]
[0083] 本発明宿主細胞中において、転写を誘導できる多様なプロモーターを使用できる。好ましくはプロモーター配列は、高度に発現される遺伝子から誘導される。それからプロモーターが好ましくは誘導され、および／またはそれが発現コンストラクト組み込みに好ましい所定の標的遺伝子座に含まれる、好ましい高度に発現される遺伝子の例としては、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫまたはＰＫＩ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）などの解糖酵素をコードする遺伝子、ならびにアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、セロビオ加水分解酵素、β−ガラクトシダーゼ、アルコール（メタノール）オキシダーゼ、延長因子、およびリボソームタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な高度に発現される遺伝子特定例としては、例えばクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種からのＬＡＣ４遺伝子、それぞれハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）からのメタノールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸおよびＭＯＸ）、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）およびＡ．アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）からのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、およびＴ．リーセイ（ｒｅｅｓｅｉ）セロビオ加水分解酵素遺伝子が挙げられる。]
[0084] 真菌発現宿主中で使用するのに好ましい強力な構成的および／または誘導性プロモーターの例としては、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、ａ−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子からのＡＧ−）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターの真菌遺伝子から得られるものが挙げられる。]
[0085] 強力な酵母プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。]
[0086] 強力な細菌プロモーターの例は、α−アミラーゼおよびＳＰｏ２プロモーター、ならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターである。]
[0087] 植物細胞に適したプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、リブロース小サブユニット（ｒｕｂｉｓｃｏ ｓｓｕ）、ヒストン、イネアクチン、ファゼオリン、カリフラワーモザイクウィルス（ＣＭＶ）３５Ｓおよび１９Ｓ、およびサーコウィルスプロモーターが挙げられる。]
[0088] 上述の全てのプロモーターは、当該技術分野で容易に入手できる。]
[0089] ベクターはポリヌクレオチドの隣接配列をさらに含んで、真核生物ゲノム配列またはウィルスゲノム配列に相同的な配列を含んでなるＲＮＡを生成してもよい。これは宿主細胞ゲノムへの本発明のポリヌクレオチドの導入を可能にする。]
[0090] ベクターはアンチセンス方向を向いた本発明のポリヌクレオチドを含有して、アンチセンスＲＮＡの生成を提供してもよい。]
[0091] ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を通じて原核生物または真核細胞に導入できる。本明細書での用法では、「形質転換」および「形質移入」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、形質導入、感染、リポフェクション、カチオン性脂質媒介形質移入または電気穿孔をはじめとする、外来性核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための多様な当業者に認識された技術を指すことが意図される。宿主細胞を形質転換または形質移入する適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年）、Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６年）、およびその他の実験マニュアルに見られる。]
[0092] 哺乳類細胞の安定した形質移入のためには、使用される発現ベクターおよび形質移入技術次第で、ほんの一部の細胞のみがそれらのゲノムに外来性ＤＮＡを取り込むかもしれないことが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質への抵抗性）をコードする遺伝子が、関心のある遺伝子と共に宿主細胞に一般に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、薬剤抵抗性を与え、または宿主細胞中の欠損を補完するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。それらとしては、例えばアセトアミダーゼ遺伝子またはｃＤＮＡ（Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）またはＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）からのａｍｄＳ、ｎｉａＤ、ｆａｃＡ遺伝子またはｃＤＮＡ）、またはＧ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、メトトレキサート、フレオマイシンまたはベノミル抵抗性（ｂｅｎＡ）のような抗生物質に対する抵抗性を提供する遺伝子など、ほとんどの糸状菌および酵母の形質転換に使用できる用途の広いマーカー遺伝子が挙げられる。代案としては、例えばＵＲＡ３（Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのまたはその他の酵母からの類似遺伝子）、ｐｙｒＧまたはｐｙｒＡ（Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）からの）、ａｒｇＢ（Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）からの）またはｔｒｐＣなど、対応する変異宿主株を必要とする栄養要求性マーカーなどの特異的選択マーカーが使用できる。好ましい実施態様では、選択マーカー遺伝子を含まないリポペプチドを産生できる形質転換宿主細胞が得られるように、選択マーカーは発現コンストラクト導入後に形質転換宿主細胞から消去される。]
[0093] その他のマーカーとしては、ＡＴＰシンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、細菌Ｇ４１８抵抗性遺伝子（これは酵母中で使用してもよいが、真菌中では使用できない）、アンピシリン抵抗性遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ネオマイシン抵抗性遺伝子（バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子が挙げられる。ベクターは例えばＲＮＡ生成のために生体外で使用されてもよく、または宿主細胞を形質転換または形質移入するのに使用されてもよい。]
[0094] 原核生物中のタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質どちらかの発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で実施されることが多い。融合ベクターは、コードされるタンパク質に、例えば組み換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的に３つの目的を果たす。１）組み換えタンパク質の発現を増大させる、２）組み換えタンパク質の溶解度を増大させる、および３）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することで組み換えタンパク質の精製を助ける。頻繁に融合発現ベクター中では、融合部分および組み換えタンパク質の接合部にタンパク質分解的切断部位が導入されて、融合タンパク質の精製に引き続いて、融合部分から組み換えタンパク質を分離できるようにする。]
[0095] 前述のように、発現ベクターは好ましくは選択可能なマーカーを含有する。このようなマーカーとしては、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン抵抗性、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌培養ではテトラサイクリンまたはアンピシリン抵抗性が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、および特定のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などの細菌細胞と、例えばＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびＡ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種の真菌細胞と、例えばＫ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）などのクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、および／または例えばＰ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピチア（Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母と、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞と、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓメラノーマなどの動物細胞と、植物細胞が挙げられる。上述の宿主細胞のための適切な培地および条件については、当該技術分野で知られている。]
[0096] 細菌中で使用するのに好ましいベクターは、例えば本明細書に参照として引用する、国際公開第２００４／０７４４６８−Ａ１号パンフレットで開示される。その他の適切なベクターは、当業者にはすぐに分かるであろう。]
[0097] 本発明で使用するのに適した既知の細菌プロモーターとしては、本明細書に参照として引用する、国際公開第２００４／０７４４６８−Ａ１号パンフレットで開示されるプロモーターが挙げられる。]
[0098] 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することで増大させてもよい。エンハンサーは、所定の宿主細胞タイプ中においてプロモーターの転写活性を増大させる働きをする、通常約１０〜３００ｂｐであるＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーの例としては、ｂｐ１００〜２７０で複製起点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーが挙げられる。]
[0099] 小胞体内腔、細胞膜周辺腔、または細胞外環境内への翻訳タンパク質の分泌のために、発現される遺伝子に適切な分泌シグナルが組み込まれてもよい。シグナルはポリペプチドに内在性であってもよく、またはそれらは異種性シグナルであってもよい。]
[0100] 本発明に従ったポリペプチドは、融合タンパク質などの修飾形態で生成されてもよく、分泌シグナルだけでなく追加的な異種の機能的領域もまた含んでもよい。したがって例えば追加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、精製中にまたは引き続く取り扱いおよび保存中に、宿主細胞中における安定性および持続性を改善してもよい。またペプチド部分をポリペプチドに付加して、精製を容易にしてもよい。]
[0101] ［発明に従ったポリペプチド］
本発明は、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物、
（ｂ）前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７である、配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であるポリペプチド、
（ｃ）本発明に従ったポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
を含んでなる、脂肪分解脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。]
[0102] したがって本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドを含んでなる、好ましくは配列番号２のアミノ酸３４〜３０４を含んでなる、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチド、および適切な宿主中で配列番号１のポリヌクレオチドを発現させて得られるアミノ酸配列を提供する。配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であり、少なくとも９０％相同的であるペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明に含まれる。]
[0103] 別の実施態様では本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であり、前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７、好ましくは、少なくとも０．８、０．９、１．０、１．１、１．５、１．７、２、２．５、３である、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドに関する。Ｒｓｐｅｃについては、明細書の後段で定義する。]
[0104] 上のポリペプチドは、「本発明に従ったポリペプチド」という用語に集合的に含まれる。]
[0105] 「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、（一般に認識されるように）同義と見なされ、各用語は文脈の必要に応じて同義的に使用でき、ペプチジル結合によって連結した少なくとも２個のアミノ酸の鎖を示唆する。「ポリペプチド」（またはタンパク質）と言う語は、本明細書で７個を超えるアミノ酸残基を含有する鎖に対して使用される。本明細書で全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの化学式または配列は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて左から右に記述される。本明細書で使用するアミノ酸の一文字コードは一般に当該技術分野で知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年）で見ることができる。]
[0106] 「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質を表す。例えば宿主細胞中で生成された組み換え的に生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的では単離されたと見なされ、例えばＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０頁（１９８８年）で開示される一段階精製法などのあらゆる適切な技術によって実質的に精製された、天然または組み換えポリペプチドについても同様である。]
[0107] 当業者には知られているように、成熟中のプロセッシングエラーのために、配列番号２の、または配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドのＮ末端、ならびに配列番号２の、または配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドのＣ末端は不均一になり得る。特にこのようなプロセッシングエラーは、ポリペプチドの過剰発現に際して起きるかもしれない。さらにエキソプロテアーゼ活性が、不均一性を引き起こすかもしれない。不均一性が起きる度合いは、使用される宿主および発酵プロトコルにもまた左右される。このようなＣ末端プロセッシング人工産物は、配列番号２で、または配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドで示されるよりも、より短いポリペプチドまたはより長いポリペプチドをもたらすかもしれない。このようなエラーの結果として、Ｎ末端もまた不均一になるかもしれない。]
[0108] さらなる実施態様では、本発明は配列番号２に記載のポリペプチドの、または配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの少なくとも１つの機能ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、それは追加的残基を含有して位置１、または２、または３などで開始する。代案としてはそれはまた特定の残基を欠くかもしれず、結果として位置２、または３、または４などで開始するかもしれない。また追加的残基は、例えば位置３４７、３４８などでＣ末端に存在してもよい。代案としては、Ｃ末端は特定の残基を欠くかもしれず、結果として位置３４５、または３４４などで終結するかもしれない。]
[0109] 本発明に従った脂肪分解酵素は、当該技術分野で知られている方法によって組み換え細胞培養物から回収して精製できる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ ｂｙ Ｐａｕｌ Ｃｕｔｌｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４年）。]
[0110] 本発明のポリペプチドとしては、天然精製産物、化学合成手順の産物、および例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳類細胞をはじめとする、原核生物または真核生物宿主から組み換え技術によって生成される産物が挙げられる。組み換え生産手順に採用される宿主次第で、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。さらに本発明のポリペプチドはまた、場合によっては宿主媒介プロセスの結果として、修飾された開始メチオニン残基を含んでもよい。]
[0111] ［ポリペプチド断片］
本発明は、また本発明に従ったポリペプチドの生物学的活性断片を特徴とする。]
[0112] 本発明のポリペプチドの生物学的活性断片は、本発明に従ったタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であり、またはそれから誘導されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（例えば配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチド）を含み、それは全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示し、それは好ましくは脂肪分解活性を示す。典型的に生物学的活性断片は、本発明に従ったタンパク質の少なくとも１つの活性があるドメインまたはモチーフを含んでなる。本発明のタンパク質の生物学的活性断片は、例えば配列番号２中の成熟ポリペプチドよりもアミノ酸長が５、１０、１５、２０、２５個以上より短く、配列番号２中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチドであることができる。さらにタンパク質のその他の領域が欠失している別の生物学的活性部分を組み換え技術によって調製し、本発明のポリペプチドの天然形態の生物学的活性の１つ以上について評価できる。]
[0113] 本発明はまた、上の本発明に従ったタンパク質の生物学的活性断片をコードする核酸断片も特徴とする。]
[0114] ［融合タンパク質］
本発明に従ったポリペプチドまたはその機能的同等物、例えばその生物学的活性部分は、本発明に従っていないポリペプチド（例えば異種のアミノ酸配列）と作動的に連結して融合タンパク質を形成できる。「本発明に従っていないポリペプチド」とは、本発明に従ったタンパク質と実質的に相同的でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを指す。このような「本発明に従っていないポリペプチド」は、同一または異なる生物に由来することができる。融合タンパク質中で、本発明に従ったポリペプチドは、本発明に従った脂肪分解酵素の全体または生物学的活性断片に相当できる。好ましい実施態様では、融合タンパク質は、本発明に従ったタンパク質の少なくとも２つの生物学的活性部分を含んでなる。融合タンパク質で「作動的に連結する」という用語は、本発明に従ったポリペプチドと本発明に従っていないポリペプチドとが、互いにフレーム内融合することを示すことが意図される。本発明に従っていないポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合できる。]
[0115] 例えば一実施態様では、融合タンパク質は、アミノ酸配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合する融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、本発明に従った組み換えタンパク質の精製を容易にできる。別の実施態様では、本発明に従った融合タンパク質は、そのＮ末端に異種性シグナル配列を含有するタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば哺乳類および酵母宿主細胞）では、本発明に従ったタンパク質の発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用を通じて増大できる。]
[0116] 別の実施例では、バキュロウィルスｅｎｖｅｌｏｐｅタンパク質のｇｐ６７分泌配列を異種性シグナル配列として使用できる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２年）。真核生物の異種性シグナル配列のその他の例としては、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列（カリフォルニア州ラホヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））が挙げられる。さらに別の例では、有用な真核生物異種性シグナル配列として、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）およびタンパク質Ａ分泌シグナル（ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ））が挙げられる。]
[0117] シグナル配列は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの分泌および単離を容易にするのに使用できる。シグナル配列は典型的に、分泌中に１つ以上の切断事象において一般に成熟タンパク質から切断される、疎水性アミノ酸コアによって特徴付けられる。このようなシグナルペプチドは、成熟タンパク質が分泌経路を通過する際に、それらからのシグナル配列の切断を可能にするプロセッシング部位を含有する。シグナル配列は、発現ベクターが形質転換された真核生物宿主などからのタンパク質の分泌を誘導し、シグナル配列は引き続いてまたは同時に切断される。次にタンパク質は、既知の方法によって細胞外の培地から容易に精製できる。代案としては、シグナル配列は、ＧＳＴドメインなどの精製を容易にする配列を使用して、関心のあるタンパク質に結合させることができる。したがって例えばポリペプチドをコードする配列は、ペプチドをコードする配列などのマーカー配列に融合されてもよく、それは融合ポリペプチドの精製を容易にする。本発明のこの態様の特定の好ましい実施態様では、マーカー配列は、特にｐＱＥベクター（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））中で提供されるｔａｇなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１〜８２４頁（１９８９年）で記載されているように、例えばヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合よい精製を提供する。ＨＡｔａｇは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当する、精製に有用な別のペプチドであり、例えばＷｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４年）で記載されている。]
[0118] 好ましくは本発明に従った融合タンパク質は、標準組み換えＤＮＡ技術によって生成される。例えば異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、例えばライゲーションのための平滑末端化または付着末端化された末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを採用することにより、従来の技術に従って共にフレーム内でライゲートされる。別の実施態様では、融合遺伝子は、自動化されたＤＮＡ合成機をはじめとする従来の技術によって合成できる。代案としては、２つの連続的遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施でき、それを引き続いてアニールおよび再増幅して、キメラ遺伝子配列を作り出せる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照されたい）。さらに元から融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド）をコードする、多数の発現ベクターが市販されている。本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸は、本発明に従ったタンパク質に融合部分がフレーム内で連結されるように、このような発現ベクターにクローンできる。]
[0119] ［機能的同等物］
「機能的同等物」および「機能的変異型」という用語は、本明細書で同義的に使用される。]
[0120] 本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、本発明に従った脂肪分解酵素の少なくとも特定の機能を示すポリペプチド、好ましくは脂肪分解活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドである。本発明に従ったポリペプチドの機能的同等物は、配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、本発明に従った脂肪分解酵素の少なくとも１つの機能を示すポリペプチドであり、好ましくはそれは脂肪分解活性を示す。これと共に言及される機能的同等物はまた、上述のような脂肪分解活性を有する生物学的活性断片も包含する。]
[0121] 本発明に従ったポリペプチドの機能的同等物は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の成熟ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸の置換、または酵素の特定の機能性に効果を与えないアミノ酸の置換、挿入または欠失を含有してもよい。したがって機能的中立アミノ酸置換は、その特定の機能性を実質的に変更しない、配列番号２に記載のアミノ酸配列の成熟ポリペプチド中の置換である。例えば本発明のタンパク質中で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れにくいことが予測される。さらに本発明に従ったタンパク質で保存されているアミノ酸、およびその他の脂肪分解酵素は、変更を受け入れにくい可能性が高い。]
[0122] 本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、典型的に、コードされるポリペプチドの生物学的機能を変更しないサイレント変異または変異群を含有してもよい。したがって本発明は、特定の生物学的活性に必須でないアミノ酸残基の変更を含有する、本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。このようなタンパク質は配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるが、なおもその少なくとも１つの生物学的活性を保ち、好ましくはそれらは脂肪分解活性を保つ。一実施態様では本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、本発明に従ったポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的である、実質的に相同的なアミノ酸配列を含んでなる。一実施態様では配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物は、アミノ酸配列配列番号４に記載の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドである（以下Ｌ０２と称する）。別の実施態様では、それはアミノ酸配列配列番号６に記載の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり（以下Ｌ０３と称する）、なおもさらに別の実施態様では、それはアミノ酸配列配列番号８に記載の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドである（以下Ｌ０４と称する）。好ましい実施態様では、それぞれ配列番号４、配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドは、それぞれ配列番号４、配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸配列３４〜３０４である。]
[0123] 本発明に従ったポリペプチドをコードする本発明に従ったポリヌクレオチドの機能的同等物は、配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的なポリヌクレオチド配列を含んでなる。]
[0124] 一実施態様では、配列番号１に記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり（ＤＮＡ Ｌ０２と称する）、別の実施態様ではそれは配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり（ＤＮＡ Ｌ０３と称する）、さらに別の実施態様ではそれは配列番号７に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである（ＤＮＡ Ｌ０４と称する）。配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列は配列番号４に記載のポリペプチドをコードし、配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列は配列番号６に記載のポリペプチドをコードし、配列番号７に記載のポリヌクレオチド配列は配列番号８に記載のポリペプチドをコードする。好ましい実施態様では、配列番号３、５、７中のポリヌクレオチド１００〜９１２は、それぞれ配列番号４、６、８中の成熟ポリペプチドをコードする。]
[0125] 配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに相同的なタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、コードされるタンパク質に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入が導入されるように、配列番号１に記載のコードヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することで作り出せる。このような変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準技術によって導入されてもよい。]
[0126] 配列番号１、３、５、７とは異なるヌクレオチド配列を有して上述の条件を満たす、脂肪分解活性を有するその他のファミリーメンバーをコードする核酸は、本発明の範囲内である。さらに配列番号２、４、６、８のアミノ酸配列の成熟ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有して上述の条件を満たす、脂肪分解活性を有するタンパク質をコードする核酸は、本発明の範囲内である。]
[0127] 本発明に従ったポリヌクレオチドは、好ましくは国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／または国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットで記載されている方法に従って、それらのコドン使用が最適化されてもよい。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットは、コドンペア最適化に対処する。コドンペア最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそれらのコドン使用頻度、特に使用されるコドンペアに関して変更して、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の改善された発現および／またはコードされるポリペプチドの改善された生成を得る方法である。コドンペアは、コード配列中の２つの引き続く三つ組（コドン）の組と定義される。]
[0128] 変異型に対応する核酸分子（例えば天然の対立遺伝子変異体）および本発明に従ったポリヌクレオチドの相同体は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準ハイブリダイゼーション技術に従って、ハイブリダイゼーションプローブとして本明細書で開示されるｃＤＮＡまたはその適切な断片を使用して、本明細書で開示される核酸とそれらの相同性に基づいて単離できる。]
[0129] 本発明の他の態様では、改善されたタンパク質が提供される。改善されたタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性と比べると、少なくとも１つの生物学的活性が改善されているタンパク質である。このようなタンパク質は、飽和変異誘発などによって、配列番号１のコード配列の全部または一部に沿って変異を無作為に導入して得られてもよく、得られた変異体は組み換え的に発現され、生物学的活性についてスクリーンできる。例えば脂肪分解酵素の酵素活性、ひいては改善されたタンパク質を測定する標準アッセイを提供する技術が容易に選択される。]
[0130] 好ましい実施態様では、本発明に従ったポリペプチドは、配列番号２中のアミノ酸３４〜３０４に一致するアミノ酸配列を有する。別の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％相同的であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保ち、好ましくはそれは脂肪分解活性を保つが、上述のような自然変動または変異誘発のためにアミノ酸配列はなおも異なる。]
[0131] さらなる好ましい実施態様では、本発明に従ったタンパク質は、配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする、単離された核酸断片によってコードされるアミノ酸配列を有し、前記ヌクレオチド配列は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同的である。]
[0132] したがって本発明に従ったタンパク質は、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同的なアミノ酸配列を含んでなり、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの少なくとも１つの機能活性を保つタンパク質である。]
[0133] 本発明に従ったタンパク質の機能的同等物はまた、例えば本発明のタンパク質の変異体、例えばトランケーション変異体のコンビナトリアルライブラリーを脂肪分解酵素活性についてスクリーニングすることで同定できる。一実施態様では、変異型の多様化ライブラリーが、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発によって作り出される。変異型の多様化ライブラリーは、可能なタンパク質配列の縮重の組が個々のポリペプチドとして、または代案としては（例えばファージディスプレイのために）より大きな融合タンパク質の組として発現できるように、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることで生成できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から、本発明のポリペプチドの可能な変異型のライブラリーを作成するのに使用できる多様な方法がある。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該技術分野で知られている（例えばＮａｒａｎｇ（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６頁；Ｉｋｅら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７頁を参照されたい）。]
[0134] さらに本発明のポリペプチドコード配列の断片のライブラリーは、引き続く変異型選択スクリーニングのためのポリペプチドの多様化集団を作り出すのに使用できる。例えば分子あたり約１個のみにニッキングが起きる条件下で、関心のあるコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理して二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを再生して異なるニック生成物からのセンス／アンチセンスペアを含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって再編成された二本鎖から一本鎖部分を除去して、得られる断片ライブラリーを発現ベクターにライゲートすることで、コード配列断片のライブラリーを作り出すことができる。この方法によって、関心のあるタンパク質のＮ末端および様々なサイズの内部断片をコードする、発現ライブラリーを得ることができる。]
[0135] トランケーションの点突然変異によって作られたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、そして選択された特質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野で知られている。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために、ハイスループット分析を受け入れやすい最も広く使用されている技術は、典型的に遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングするステップと、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換するステップと、所望の活性の検出が、その生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現するステップを含む。ライブラリー中の機能的変異体の発生頻度を増強する技術である再帰アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）が、本発明のタンパク質の変異型を同定するスクリーニングアッセイとの併用で使用できる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１〜７８１５頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７〜３３１頁）。]
[0136] 本発明に従ったポリヌクレオチドの断片はまた、機能的ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応のためのプローブまたはプライマーとして機能してもよい。]
[0137] 本発明に従った核酸は、それらが機能的または非機能的ポリペプチドをコードするかどうかに関わりなく、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用できる。本発明に従った脂肪分解活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途としては、とりわけ以下が挙げられる。（１）タンパク質をコードする遺伝子、またはその対立遺伝子変異体のｃＤＮＡライブラリーからの単離、（２）Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８年）で記載されているような遺伝子の正確な染色体位置を提供する、分裂中期染色体スプレッドへの原位置ハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）、（３）特定の組織および／または細胞中のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット法分析、および４）所定の生物学的（例えば組織）サンプル中でプローブとハイブリッド形成できる、核酸の存在を分析する診断ツールとして使用できる、プローブおよびプライマー。]
[0138] 本発明に従った遺伝子の機能的同等物を得る方法もまた、本発明に包含される。このような方法は、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと一致するタンパク質配列の全部または一部、またはそれらのいずれかの変異型をコードする単離された核酸を含む標識プローブを得るステップと、ライブラリー中の核酸断片へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、核酸断片ライブラリーを標識プローブでスクリーニングするステップと、それによって核酸二本鎖を形成するステップと、あらゆる標識二本鎖中の核酸断片から全長遺伝子配列を調製して、本発明に従った遺伝子と関係がある遺伝子を得るステップを伴う。]
[0139] ［宿主細胞］
別の実施態様では、本発明は、例えば本発明に従ったポリヌクレオチドを含んでなる、または本発明に従ったベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞または組み換え宿主細胞である細胞を特徴とする。]
[0140] 「形質転換細胞」または「組み換え細胞」は、組み換えＤＮＡ技術の手段によって、その中に（またはその原細胞中に）本発明に従った核酸が導入されている細胞である。例えば細菌、真菌、酵母などの原核および真核細胞の双方が含まれる。宿主細胞としてはまた、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および脈絡叢細胞系などの哺乳類細胞系も挙げられるが、これに限定されるものではない。哺乳類細胞の安定した形質移入に適したいくつかのベクターが一般に入手でき、このような細胞系を構築する方法もまた例えばＡｕｓｕｂｅｌら（前出）などで公に知られている。特に好ましいのは、糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはコウジカビウ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からの細胞である。]
[0141] 特定の所望の様式で、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞が選択できる。タンパク質産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の最適な機能を促進するかもしれない。]
[0142] 様々な宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的な特定の機序を有する。分子生物学および／または微生物学の当業者に良く知られている適切な細胞系または宿主系を選択して、外来性タンパク質産物の所望される正確な修飾およびプロセッシングを確実にできる。この目的を達成するために、一次転写産物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびホスホリル化ための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用できる。このような宿主細胞については、当該技術分野で良く知られている。]
[0143] 所望ならば、上述のような細胞を本発明に従ったポリペプチドの調製において使用してもよい。このような方法は、典型的にポリペプチドをコードするコード配列の（ベクターによる）発現を提供する条件下で、（例えば上述のように発現ベクターで形質転換または形質移入された）組み換え宿主細胞を培養するステップと、細胞または培地から生成ポリペプチドを任意に回収し、より好ましくは回収して精製するステップを含んでなる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば発現ベクターなどの組み換え複製可能なベクターに組み込むことができる。適合性宿主細胞中でベクターを使用して、核酸を複製してもよい。したがってさらなる実施態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、ベクターを適合性宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を生育させることにより、本発明のポリヌクレオチドを作成する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。]
[0144] 好ましくはポリペプチドは分泌タンパク質として生成され、その場合、発現コンストラクト中のポリペプチドの成熟形態をコードするヌクレオチド配列は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列と作動的に連結する。好ましくはシグナル配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にとって天然（相同的）である。代案としてはシグナル配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にとって外来性（異種性）であり、その場合、シグナル配列は好ましくは、本発明に従ったヌクレオチド配列が発現される宿主細胞に内在性である。酵母宿主細胞に適切なシグナル配列の例は、酵母α因子遺伝子に由来するシグナル配列である。同様に糸状菌宿主細胞のための適切なシグナル配列は、例えばＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡ遺伝子などの糸状菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子に由来するシグナル配列である。これはアミログルコシダーゼ（（グルコ）アミラーゼとも称される）プロモーターそれ自体との併用で、ならびにその他のプロモーターとの併用で使用してもよい。ハイブリッドシグナル配列はまた、本発明の文脈で使用してもよい。]
[0145] 好ましい異種の分泌物リーダー配列は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からの１８および２４アミノ酸バージョンの双方）、α因子遺伝子（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母）またはα−アミラーゼ遺伝子（バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））を起源とするものである。]
[0146] ベクターを上述のような適切な宿主細胞に形質転換または形質移入して、本発明のポリペプチドの発現を提供してもよい。この過程は、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を提供する条件下で、前述のような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップを含んでなってもよい。]
[0147] したがって本発明は、ポリヌクレオチドまたは本発明のベクターで形質転換または形質移入された、またはそれを含んでなる宿主細胞を提供する。好ましくはポリヌクレオチドの複製および発現のために、ポリヌクレオチドはベクター内で運ばれる。細胞は前記ベクターに適合するように選択され、例えば原核生物（例えば細菌）、真菌、酵母または植物細胞であってもよい。]
[0148] 本発明のポリペプチドが、利用を妨げるかもしれない酵素活性を実質的に含まない形態で、例えばデンプン分解、セルロース分解またはヘミセルロース分解酵素を含まない形態で生成される、異種の宿主もまた選択されてもよい。これは常態ではこのような酵素を産生しない宿主を選択することで、達成されてもよい。]
[0149] 本発明は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の組み換え発現の手段によって、本発明のポリペプチドを生成する方法を包含する。この目的のために、本発明のＤＮＡ配列は、適切な相同的なまたは異種の宿主細胞中でのポリペプチドの経済的生産を可能にするために、遺伝子増幅および／またはプロモーター、分泌シグナル配列などの発現シグナル交換のために使用できる。相同的な宿主細胞とは、それにＤＮＡ配列が由来する種と同一種であり、または同一種内の変異型である宿主細胞である。]
[0150] 適切な宿主細胞は、好ましくは細菌などの原核微生物、またはより好ましくは例えば酵母または糸状菌などの真菌、または植物細胞などの真核生物である。操作がより容易であることことから、一般に酵母細胞が真菌細胞よりも好ましい。しかしいくつかのタンパク質は酵母からの分泌が不良であり、または場合によっては適切にプロセッシングされない（例えば酵母中での過グリコシル化）。これらの場合、真菌宿主生物を選択すべきである。]
[0151] 宿主細胞はポリペプチドを過剰発現してもよく、過剰発現を画策する技術については良く知られている。したがって宿主は、ポリヌクレオチドをコードする２つ以上のコピーを有してもよい（したがってベクターはそれに応じて２つ以上のコピーを有してもよい）。]
[0152] したがって本発明の一実施態様では、本発明に従った組み換え宿主細胞は、本発明に従ったポリヌクレオチドまたはベクターを発現または過剰発現できる。]
[0153] 本発明に従って、従来の栄養素発酵培地中における、１つ以上の本発明のポリヌクレオチドで形質転換されている本発明に従った宿主細胞の培養によって、本発明のポリペプチドの生成をもたらすことができる。]
[0154] 本発明に従った組み換え宿主細胞は、当該技術分野で知られている手順を使用して培養されてもよい。プロモーターと宿主細胞の各組み合わせのためには、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現に貢献する培養条件が利用できる。所望の細胞密度またはポリペプチド力価に達した後、培養を停止し、ポリペプチドを既知の手順を使用して回収する。]
[0155] 発酵培地は、炭素源（例えばグルコース、マルトース、糖蜜など）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど）、有機窒素源（例えば酵母抽出物、麦芽エキス、ペプトンなど）、および無機栄養源（例えばリン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄など）を含有する、既知の培地を含んでなることができる。]
[0156] 適切な培地の選択は、発現宿主の選択に基づいてもよく、および／または発現コンストラクトの調節要件に基づいてもよい。このような培地は当業者に知られている。培地は所望ならば、その他の潜在的汚染微生物よりも形質転換された発現宿主にとって有利な、追加的構成要素を含有してもよい。]
[0157] 発酵は、０．５〜３０日間にわたって実施できる。それは適切には、例えば約０〜４５℃の範囲の温度および／または例えば約２〜約１０のｐＨにおけるバッチ、連続、または流加工程であってもよい。好ましい発酵条件は、約２０〜約３７℃の範囲の温度および／または約３〜約９のｐＨである。適切な条件は、通常、発現宿主および生成されるタンパク質の選択に基づいて選択される。]
[0158] 発酵後、必要ならば、遠心分離または濾過の手段によって細胞を発酵ブロスから除去できる。次に発酵停止後、または細胞除去後、本発明のポリペプチドを回収してもよく、所望ならば、従来の手段によって精製および単離してもよい。]
[0159] ［産業工程における脂肪分解酵素の使用］
本発明はまた、いくつかの産業工程における本発明に従った脂肪分解酵素の使用に関する。これらの工程で得られた長期的経験にもかかわらず、本発明に従った脂肪分解酵素は目下使用されている酵素に優るいくつかの顕著な利点を特徴とする。特定の応用次第で、これらの利点としては、より低い製造コスト、基質に対するより高い特異性、より少ない抗原性、より少ない望ましくない副活性、適切な微生物中で生成した際のより高い収率、より適切なｐＨおよび温度範囲、最終製品のより良い味ならびに食品等級およびコーシャの側面などの側面が挙げられる。]
[0160] 好ましくは脂肪分解活性を有する単離された本発明に従ったポリペプチドは、食品産業において、より好ましくは食品製造において使用できる。]
[0161] ［乳製品応用］
好ましい一実施態様では、本発明に従ったポリペプチドは乳業で使用できる。]
[0162] 一実施態様では、本発明に従ったポリペプチドは、乳製品、好ましくはチーズ、チーズ様製品、ＥＭＣ、または乳脂肪由来遊離脂肪酸混合物の製造で使用され、好ましくは乳製品の風味を生成しおよび／または増強させる。]
[0163] 本発明の文脈で「乳製品」とは、チーズ、バター、ＥＭＣ、クリーム、乳製品類似体などをはじめとするがこれに限定されるものではない、あらゆる種類のミルクベースの製品を指す。本文脈で特に興味深いのは、普通のチーズ、アナログチーズ、プロセスチーズ、バター、スプレッド、マーガリン、ＥＭＣなどをはじめとする、乳脂肪含有製品およびそれらの同等物である。]
[0164] 好ましい実施態様では、乳製品はチーズである。チーズは、例えばチェスター、ダンボ、マンチェゴ、サン・ポーラン、チェダー、モントレー、コルビー、エダム、ゴーダ、ムンスター、スイスタイプ、グリュイエール、エメンタール、パルメザン、ペコリーノ、プロヴォローネ、およびロマーノなどの硬質チーズと、フェタなどのカードチーズと、モツァレラなどのパスタフィラータチーズと、プロセスチーズと、ブリーおよびカマンベールなどの白カビチーズ、またはゴルゴンゾラおよびデンマークブルーチーズなどの青カビチーズと、または例えばリコッタ、クリームチーズ、ヌシャテルまたはカテージチーズなどのフレッシュチーズなどのあらゆる種類であってもよい。この文脈で好ましいタイプのチーズは、パルメザン、ペコリーノ、プロヴォローネ、ロマーノ、フェタである。]
[0165] 「乳製品類似体」という用語は、組成物の一部として脂肪（例えばクリームなどの乳脂肪）を含有する乳製品様製品を指し、それは組成物の一部として例えば植物油などの非乳構成物をさらに含有する。]
[0166] 本発明はまた、本発明に従った単離されたポリペプチドが、乳製品の製造において使用される乳製品組成物に添加される、乳製品を調製する方法に関する。]
[0167] 本発明の文脈で乳製品組成物とは、乳および／または１つ以上の乳構成要素および／または本発明に従った乳製品の生産における出発組成物である乳画分を含んでなる組成物であってもよく、またはそれは乳製品（例えばカードまたは乳清）の生産における中間生成物であってもよい。乳製品組成物は脂肪分解酵素の適切な基質であり、したがって乳製品組成物は、少なくとも乳脂肪および／または例えば植物由来脂肪などのその他の脂肪を含んでなる。本発明に従った脂肪分解酵素は、乳製品組成物中に存在するグリセリド中のエステル結合の加水分解を触媒でき、したがってそれらはリパーゼ活性を有する。グリセリドは、グリセロールおよび脂肪酸のエステルである。トリグリセリド（トリアシルグリセロールまたはトリアシルグリセリドとしてもまた知られている）は、主に植物油および動物脂肪中に存在する。リパーゼ（ＥＣ ３．１．１．３）は、本明細書で脂質から脂肪酸の１つ以上を加水分解する酵素と定義され、より具体的にはそれらはグリセロールの脂肪酸および水酸基の間のエステル結合を加水分解する。]
[0168] 乳構成要素は、乳脂肪、乳タンパク質、カゼイン、乳清タンパク質、乳糖などの乳のあらゆる構成物であってもよい。乳画分は、例えば脱脂乳、バターミルク、乳清、クリーム、バター、限外濾過処理乳、粉乳、全脂粉乳、粉末バターミルク、または脱脂粉乳などの乳のあらゆる画分であってもよい。本文脈中では、乳は、あらゆる哺乳類の乳糜管分泌物であってもよい。したがって乳は、雌牛、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、またはラクダを搾乳して得られてもよい。]
[0169] 本発明のこの態様の方法によって製造される乳製品は、当該技術分野で知られているあらゆる適切な方法によって製造されてもよく、脂肪分解酵素は、乳製品の製造におけるあらゆる適切な工程で、例えば酵素がその脂肪分解活性を発揮するのに十分な酵素濃度、温度、および時間などの適切な条件下で、乳製品組成物に添加される。]
[0170] 一実施態様では、本発明に従った方法は、チーズを製造する方法である。この場合、方法はレンネットを用いた乳製品組成物の酵素的凝固によって、または食品等級酸または乳酸細菌成長によって生成される酸を用いた酸性凝固によってカードが形成さるステップと、それが引き続いて乳清から分離されるステップを含んでなる。製造されるチーズのタイプ次第で、チーズの製造は、カードを加工して得られたチーズを熟成させるステップをさらに含んでなってもよい本発明のこの態様に従ってチーズを製造する方法は、好ましくは得られたチーズを熟成させるステップを含む。脂肪分解酵素は、チーズ調製の様々な段階で、乳製品組成物に添加できる。好ましくは酵素は、凝固剤（例えばキモシン）の添加に先だって、またはそれと共に乳に添加される。この時点での添加は、チーズ全体にわたる酵素の均質な分布を確実にする。代案としては酵素は後の段階で、例えばカードに添加できるが、これはチーズ中の不均質な酵素分布のリスクをもたらす。その理由から乳への酵素の添加が好ましい。]
[0171] 別の実施態様では、本発明に従った乳製品を製造する方法は、遊離脂肪酸混合物を生じる乳脂肪（例えばバター脂肪またはクリーム）の脂肪分解によって得られる、乳脂肪由来遊離脂肪酸混合物の製造であり、これは例えばブルーチーズ風味など例えば風味付けに使用できる。これらの遊離脂肪酸混合物は、例えばスプレッド、スープ、ドレッシング、スナック、チップ、ナッチョ）などのその他の製品の製造において、風味成分として使用できる。その他のリパーゼ用途としては、調製粉乳中での使用が挙げられる（Ｋｉｌａｒａ，「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」より，（２００３年；Ｆｏｘら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）９１４〜９１８頁）。]
[0172] さらに別の実施態様では、本発明に従った乳製品を製造する方法は、ＥＭＣを製造する方法である。この場合、方法は典型的に、当業者に知られているを条件使用して実施できる（例えば「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，第２版，Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｗｅｓｔ編，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９６年の第２．１２章；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら，「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」より，（２００３年；Ｆｏｘら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）４３４〜４３８頁を参照されたい）。]
[0173] 上述の方法のいずれか１つで、添加する酵素の量は酵素活性および最終製品中の所望の風味効果に左右される。当業者は用量反応曲線を使用して、用途で使用される量を測定できる。このアプローチでは、増大する量の酵素が乳製品組成物に添加され、引き続いて訓練された味覚パネルにより最終製品中の風味プロフィールの強度が分析される。]
[0174] 本発明に従った使用の、または本発明に従った乳製品を製造する方法の好ましい実施態様では、風味の生成および／または増強のために本発明に従った脂肪分解酵素が使用される。乳製品の製造中の風味生成は、特に、乳製品の製造中に使用される微生物によって産生されるか、または製造中に特に添加されるかに関わらず、酵素の作用に起因し、より具体的には脂肪分解およびタンパク質分解酵素の作用に起因する。]
[0175] 脂肪分解酵素は、乳製品中に存在する乳脂肪の脂肪分解、および結果的な遊離脂肪酸混合物（以下ＦＦＡと表す）の製品中への放出の原因である。遊離脂肪酸混合物の組成物は、部分的に乳製品の最終風味の原因である。乳脂肪を含有する基質に始まって、脂肪分解酵素はＣ４〜Ｃ１８含有遊離脂肪酸の特定のＦＦＡ混合物を生じ、混合物中の各構成要素の相対量は、トリグリセリド中に存在するＣ４〜Ｃ１８含有脂肪酸を伴う特定のトリグリセリドエステル結合の加水分解に対する酵素の特異性に左右される。例えばＣ４含有脂肪酸に対する高特異性を有する脂肪分解酵素は、Ｃ６〜Ｃ１８含有脂肪酸よりもＣ４含有脂肪酸があるトリグリセリド部分のトリグリセリドエステル結合を優先的に加水分解し、Ｃ６〜Ｃ１８含有遊離脂肪酸の相対含量と比べると、混合物中のＣ４含有遊離脂肪酸の相対含量がより高くなるであろう。さらに混合物中の各構成要素の相対量はまた、出発基質、およびその中に存在するトリグリセリドの組成にも左右されるであろう。あらゆる脂肪酸は、製品に特定の風味特性を与える原因であるので、酵素が反応するのに十分な酵素濃度、温度、および時間の条件下において、特定の乳脂肪を含有する基質が脂肪分解酵素作用を受けると、特定の風味プロフィールを生じる特定のＦＦＡ混合物が基質中に生成する。遊離脂肪酸の放出に対するいくつかの脂肪分解酵素の特異性、ひいては生成される風味プロフィールは、同一基質を使用した各酵素のＦＦＡプロフィールの判定によって互いに比較できる。ＦＦＡプロフィールは、基質に対する脂肪分解酵素の作用によって放出される遊離脂肪酸総量に対する、各Ｃ４〜Ｃ１８含有遊離脂肪酸の相対量を与える。ＦＦＡプロフィールは、一般に出発基質、脂質組成物中の脂肪酸置換基に対する脂肪分解酵素の特異性に依存するであろう。]
[0176] 脂肪転換の程度（Ｄ）は、次のように計算される（％で表される）：
Ｄ＝[（脂肪分解酵素処理組成物中の総ＦＦＡ量）−（未処理組成物中の総ＦＦＡ量）]／（組成物中に存在する総脂肪酸）。総ＦＦＡ量および総脂肪酸量は、ｍｏｌ／ｋｇ基質で表される。]
[0177] 基質から開始してＦＦＡプロフィールを判定する適切な方法については、実施例で述べる。]
[0178] 本発明に従った脂肪分解酵素は好ましくは、より長鎖の遊離脂肪酸、すなわちＣ１２〜Ｃ１８含有遊離脂肪酸の放出と比べると、短鎖遊離脂肪酸、すなわちＣ４〜Ｃ１０含有遊離脂肪酸、好ましくはＣ４含有遊離脂肪酸の放出に対するより高い特異性を有する。好ましい実施態様では、本発明に従った脂肪分解酵素は、Ｃ１２〜Ｃ１８含有遊離脂肪酸と比べると、特異性比（Ｒｓｐｅｃ）で表されるＣ４〜Ｃ１０含有遊離脂肪酸に対する特異性の程度が、少なくとも０．７、好ましくは少なくとも０．８、０．９、１、１．１、１．５、１．７、２、２．５、３である。一般にＲｓｐｅｃは到達可能な限りに高い。]
[0179] Ｒｓｐｅｃは次のように計算できる：
Ｒｓｐｅｃ＝ΣＣ４〜Ｃ１０相対含量／ΣＣ１２〜Ｃ１８相対含量
式中、「ΣＣ４〜Ｃ１０相対含量」とは、脂肪分解酵素で処理された組成物中に存在するＣ４含有、Ｃ６含有、Ｃ８含有、およびＣ１０含有遊離脂肪酸の相対含量の和であり、「ΣＣ１２〜Ｃ１８相対含量」とは、脂肪分解酵素で処理された組成物中に存在するＣ１２含有、Ｃ１４含有、Ｃ１６含有、およびＣ１８含有遊離脂肪酸の相対含量の和である。]
[0180] Ｘが４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８のいずれかであることができる「Ｃｘ相対含量」は、脂肪分解酵素で処理された組成物中に存在する遊離脂肪酸総量に対する、脂肪分解酵素で処理された組成物中のＣｘ含有遊離脂肪酸量の百分率（％）に相当する。前述の式中のＦＦＡ（または遊離脂肪酸）の量はｍｏｌ／ｋｇで表される。]
[0181] Ｒｓｐｅｃは、短期熟成チーズ（好ましくはチェダーまたはゴーダチーズ、好ましくは熟成期間が２週間未満の短期熟成チーズ）を使用して、製造された乳製品組成物中で測定され、脂肪分解酵素は、インキュベートされたサンプル中に５％〜２５％の脂肪転換の程度をもたらす（用量、インキュベーション期間、およびインキュベーション温度などの）条件下でインキュベートされ、脂肪転換の程度は上述の通りに計算される。]
[0182] 本発明はまた、本発明に従った方法によって得られる乳製品に関する。]
[0183] 本発明に従ったあらゆる単離されたペプチドの使用、または本発明に従った乳製品の製造方法の好ましい実施態様では、ΣＣ４〜Ｃ１０相対含量／ΣＣ１２〜Ｃ１８相対含量は少なくとも０．７であり、好ましくは少なくとも０．８、０．９、１、１．１、１．５、１．７、２、２．５、３である。例えば反芻動物前胃エステラーゼで処理されたパルメザンチーズでは、この比率はおよそ１．７である（Ｄ．Ｔ．Ｌａｉ，Ａ．Ｄ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｃ．Ｊ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｗ．Ｔｕｒｎｅｒ Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８０：２２４９〜２２５７頁（１９９７年），２２５５頁のデータから計算される）。「Ｃ４〜Ｃ１０相対含量」および「Σ相対Ｃ１２〜Ｃ１８」は、上と同じ意味を有する。]
[0184] 当該技術分野では、脂肪分解酵素が乳脂肪を含有する基質に作用すると、主として短鎖脂肪酸（例えばＣ４およびＣ６を含有する脂肪酸）を放出し、これはぴりっと辛くシャープでスパイシーなツーンとする風味の発生をもたらす一方で、例えば中鎖脂肪酸の放出は石鹸のような味をもたらすことが知られている。]
[0185] したがって本発明の使用、または本発明に従った乳製品の製造方法の好ましい実施態様では、乳製品の風味プロフィールにおいてシャープでツーンとする匂いのスパイシーな香気が増大し、好ましくは乳製品の風味プロフィール中の石鹸のような香気は減少する。]
[0186] 本発明のさらなる態様は、本発明に従った乳製品を調製する方法によって得られる乳製品に関する。適切な乳製品の例は、本発明の先行する態様で言及されたものである。]
[0187] ［製パン用途］
食品中における本発明に従った脂肪分解酵素の産業上の利用の別の例は、生地および／またはベークド製品の質を改善するための製パン用途におけるその使用である。]
[0188] 意外にも、本発明に従った脂肪分解酵素は、製パン用途においてグリセリド（例えばトリグリセリド）、リン脂質、またはガラクト脂質などの糖脂質に及ぶ、いくつかのタイプの脂質に作用できることが分かった。]
[0189] より具体的には、本発明に従った脂肪分解酵素は、生地で使用すると原位置で次の特性の少なくとも１つを示す。
●無極性脂質に対する比較的低い活性。
●極性ジアシル脂質に対する、少なくともジアシルガラクト脂質に対する比較的高い活性。
●リゾガラクト脂質およびリゾリン脂質などの極性モノアシル化合物に対する比較的低い活性。]
[0190] 生地中で化学乳化剤の代替物として使用した場合、これらの意外な特性は全て極めて有利であることが分かった。]
[0191] グリセリドおよびリパーゼについては、上で定義した。]
[0192] 糖脂質（例えばガラクト脂質）は、外側（ｓｎ−１）および中央（ｓｎ−２）の位置に２つのエステル化脂肪酸があるグリセロール主鎖からなる一方、第３の水酸基は、例えばモノガラクトシルジグリセリドまたはジガラクトシルジグリセリドなどのガラクト脂質の場合はガラクトースなどの糖残基に結合する。ガラクトリパーゼ（ＥＣ３．１．１．２６）は、ガラクトシルジグリセリドから、それぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位の１つまたは双方の脂肪酸アシル基の加水分解を触媒する。]
[0193] リン脂質は、外側（ｓｎ−１）および中央（ｓｎ−２）の位置に２つのエステル化脂肪酸があるグリセロール主鎖からなる一方、グリセロールの第３の水酸基はリン酸でエステル化される。リン酸は、次に例えばアミノアルコール様エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン）、コリン（ホスファチジルコリン）にエステル化されてもよい。ホスホリパーゼは本明細書で、リン脂質中の１つ以上の結合の加水分解に関与する酵素と定義される。]
[0194] グリセロール主鎖脂肪酸アシル部分に連結するエステル結合を加水分解する、いくつかのタイプのホスホリパーゼ活性を区別できる。
●ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）およびＡ２（ＥＣ３．１．１．４）は、ジアシルグリセロリン脂質からそれぞれｓｎ−１およびｓｎ−２位置において１つの脂肪酸アシル基の脱アシル化を触媒して、リゾリン脂質を生成する。これは乳化剤代替物質にとって望ましい活性である。
●リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５−Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２年））によってホスホリパーゼＢとも称される）は、リゾリン脂質中の残る脂肪酸アシル基の加水分解を触媒する。ジアシルグリセロリン脂質からの双方の脂肪酸の脱アシル化を触媒して、リゾホスホリパーゼ活性を内在性に有するアオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）からのホスホリパーゼＢが報告されている（Ｓａｉｔｏら，１９９１年，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９７：４４６〜４５６頁）。極性頭部および無極性尾部の組み合わせの欠失をもたらし、得られた生成物は表面特性に影響できなくなことから、乳化剤代替物質にとってリゾホスホリパーゼ活性は望ましくない。意外にも本発明に従った脂肪分解酵素は、生地中で比較的低いリゾホスホリパーゼ活性を示すことが示された。]
[0195] 小麦粉はおよそ２．２〜２．９％の脂質を含有する。小麦粉脂質は、デンプン脂質（０．８〜０．９％）および非デンプン脂質（１．４〜２．０％）に分割できる。デンプン脂質が主に極性リゾリン脂質からなるのに対し、非デンプン脂質は約４０％の中性トリグリセリドおよび４０％の極性リン脂質および糖脂質からなる。小麦粉画分の最適化のために本発明に従ったリパーゼを添加することで、本発明に従ったリパーゼは生地中の原位置で、リン脂質および糖脂質、より具体的にはガラクト脂質である極性脂質を加水分解できる。]
[0196] ベーキング酵素は、多様なベークド製品で使用してもよい。「ベークド製品」という用語は、本明細書で型焼きパン、ローフパン、フランスパンならびにロールなどのパン製品、デニッシュペーストリー、クロワッサンまたはパフペーストリー製品などの積層生地製品、ケーキ、パイ、マフィン、イーストドーナツおよびケーキドーナツなどを含んでなると定義される。]
[0197] 本発明に従った脂肪分解酵素は、例えばベークド製品中で使用できる。パンなどのベークド製品は生地から調製される。したがって本発明の一実施態様は、生地の調製における単離された本発明に従ったポリペプチドの使用を提供し、本発明に従ったポリペプチドを含んでなる生地を提供する。本発明はまた、本発明に従ったポリペプチドを生地成分の少なくとも１つに添加するステップを含んでなる、生地の調製を提供する。生地は、通常、基本成分である（小麦）粉、水、および任意に塩からできている。ベークド製品次第で、添加されるその他の成分は、砂糖、香味料などであってもよい。膨張製品では、酸（酸発生化合物）および炭酸水素塩の組み合わせなどの化学的膨張システムに次いで、主にパン用酵母が使用される。]
[0198] 酵母、酵素、および化学添加剤は、一般に生地に別々に添加される。]
[0199] 酵素は、例えば顆粒形態などの乾燥状態で、または液体形態で添加されてもよい。化学添加剤はほとんどの場合、粉末形態で添加される。また特定のベーキング用途の目的に合わせた加工助剤組成物は、化学添加剤および酵素の専用混合物から構成されてもよい。]
[0200] 上述の成分および加工助剤からの生地の調製については当該技術分野で良く知られており、前記成分と加工助剤の混合、および１つ以上の型込めおよび発酵工程を含んでなる。]
[0201] このような生地からのベークド製品調製についてもまた、当該技術分野で良く知られており、生地の型込めおよび成形およびさらなる発酵と、それに続く必要とされる温度および焼成時間での焼成を含んでなってもよい。一実施態様では本発明は、本発明に従った生地を焼成するステップを含んでなる、ベークド製品を調製する方法を提供する。本発明はまた、この方法に従って得られるベークド製品を提供する。好ましくは本発明に従ったベークド製品は、パンである。]
[0202] 本発明はまた、ポリペプチドが組み込まれていない生地またはベークド製品と比較して、生地または生地から得られるベークド製品の１つ以上の特性を改善する、有効量の本発明の脂肪分解酵素を生地に組み込むステップを含んでなる、生地またはベークド製品を調製する方法に関する。]
[0203] 「生地への組み込み」という語句は、本明細書で本発明に従った脂肪分解酵素を生地に、それから生地が作られるあらゆる成分に、および／またはそれから生地が作られる生地成分のあらゆる混合物に添加することと定義される。換言すれば、本発明に従った脂肪分解酵素は、生地調製のあらゆる工程で添加されてもよく、１つ、２つまたはそれ以上の工程で添加されてもよい。本発明に従った脂肪分解酵素は、当該技術分野で良く知られている方法を使用して、混捏および焼成してベークド製品を作る生地成分に添加される。例えば米国特許第４，５６７，０４６号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−４２６，２１１号明細書、特開昭６０−７８５２９号公報、特開昭６２−１１１６２９号公報、および特開昭６３−２５８５２８号公報を参照されたい。]
[0204] 「有効量」とという用語は、本明細書で生地および／またはベークド製品の関心のある少なくとも１つの特質に対する測定可能効果を提供するのに十分な、本発明に従った脂肪分解酵素の量と定義される。]
[0205] 「特質改善」という用語は、本明細書で、本発明に従った脂肪分解酵素が組み込まれていない生地または製品と比較して、本発明に従った脂肪分解酵素の作用によって改善される、生地および／または生地から得られる製品の、特にベークド製品のあらゆる特質と定義される。特質改善としては、生地強度増大、生地弾性増大、生地安定性増大、生地粘性低下、生地伸展性改善、生地機械加工適性改善、ベークド製品体積増大、ベークド製品風味改善、ベークド製品クラム構造改善、ベークド製品クラム柔らかさ改善、ベークド製品気泡形成低下および／またはベークド製品老化防止改善が挙げられるが、これに限定されるものではない。]
[0206] 特質改善は、実施例で後述する本発明の方法に従って、本発明のポリペプチドの添加ありまたはなしで調製された生地および／またはベークド製品の比較によって判定されてもよい。官能特性は製パン工業において確立された手順を使用して評価されてもよく、例えば訓練された味覚テスターのパネルの使用を含んでもよい。]
[0207] 「生地強度増大」という用語は、本明細書で、一般により弾性がある特性を有し、および／または型込めおよび成形のためにより多くの作業入力を必要とする生地の特質と定義される。]
[0208] 「生地弾性増大」という用語は、本明細書で、物理的歪みを受けた後に、その元の形状を取り戻す傾向がより高い生地の特質と定義される。]
[0209] 「生地安定性増大」という用語は、本明細書で、機械的損傷を被りにくく、したがってその形状および体積を保つ生地の特質と定義され、通常および／または延長発酵後のローフ断面の高さ：幅の比率によって評価される。]
[0210] 「生地粘性低下」という用語は、本明細書で、例えば生地生産機械内の表面に付着する傾向がより低い生地の特質と定義され、熟練した試験パン職人によって経験的に評価され、あるいは当該技術分野で知られているようなテクスチャー分析器（例えばＴＡＸＴ２）の使用によって測定される。]
[0211] 「生地伸展性改善」という用語は、本明細書で、裂け目なしに増大した歪みまたは伸張を受けることができる生地の特質と定義される。]
[0212] 「生地機械加工適性改善」という用語は、本明細書で、一般により低粘着性でおよび／またはより堅くおよび／またはより弾性である生地の特質と定義される。]

权利要求:

請求項1
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物、（ｂ）配列番号１の補体であるポリヌクレオチドとハイブリダイズして、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同的である、ヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の成熟ポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の相同性を有するその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であり、前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７である、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれか１つで定義される配列の遺伝コードの縮重の結果として縮重する配列、（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）で定義されるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
請求項2
脂肪分解酵素をコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項3
合成的に製造される、請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項4
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの機能的同等物であり、それと少なくとも９０％の相同性を有して、配列番号３に記載のまたは配列番号５に記載のまたは配列番号７に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項5
高度ストリンジェンシー条件下で配列番号１の補体であるヌクレオチド配列とハイブリッド形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項6
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるベクター。
請求項7
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列と、適切な宿主細胞中のポリヌクレオチド配列の発現を可能にする少なくとも１つの制御配列とが作動的に連結する発現ベクターである、請求項６に記載のベクター。
請求項8
適切な宿主細胞が糸状菌である、請求項７に記載のベクター。
請求項9
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、または請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、組み換え宿主細胞。
請求項10
前記ポリヌクレオチドまたはベクターを発現または過剰発現できる、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
請求項11
前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞から前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを単離するステップを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクターを製造する方法。
請求項12
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有するその機能的同等物、（ｂ）前記成熟ポリペプチドと少なくとも６０％相同的であり、トリグリセリドに対する特異性の程度Ｒｓｐｅｃが少なくとも０．７である、配列番号２のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であるポリペプチド、（ｃ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる、脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチド。
請求項13
配列番号２に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドの機能的同等物であり、それと少なくとも９０％の相同性を有して、配列番号４に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、または配列番号６に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、または配列番号８に記載のアミノ酸配列中の成熟ポリペプチドに一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
請求項14
適切な宿主細胞中で、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクターを発現することによって得られる、請求項１２または１３に記載の単離されたポリペプチド。
請求項15
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクターの発現を可能にする条件下で、請求項９または１０に記載の組み換え宿主細胞を培養するステップと、コードされたポリペプチドを細胞または培地から任意に回収するステップを含んでなる、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
請求項16
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドの食品製造における使用。
請求項17
乳製品の製造における、好ましくはチーズ、チーズ様製品、酵素処理チーズ（ＥＭＣ）の製造における、またはバター脂肪またはクリームの脂肪分解によって得られる遊離脂肪酸混合物の製造における、請求項１６に記載の使用。
請求項18
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドが、酵素が反応するのに十分な条件下で、乳製品の製造で使用される乳製品組成物に添加される、乳製品を調製する方法。
請求項19
ΣＣ４〜Ｃ１０相対含量／ΣＣ１２〜Ｃ１８相対含量が少なくとも０．７であり、「ΣＣ４〜Ｃ１０相対含量」が脂肪分解活性を有するポリペプチドで処理された組成物中に存在するＣ４含有、Ｃ６含有、Ｃ８含有、およびＣ１０含有遊離脂肪酸の相対含量の和であり、「ΣＣ１２〜Ｃ１８相対含量」が脂肪分解活性を有するポリペプチドで処理された組成物中に存在するＣ１２含有、Ｃ１４含有、Ｃ１６含有、およびＣ１８含有遊離脂肪酸の相対含量の和である、請求項１６または１７に記載の使用または請求項１８に記載の方法。
請求項20
ポリペプチドが風味の生成において使用される、請求項１６、１７または１９に記載の使用または請求項１８または１９に記載の方法。
請求項21
乳製品の風味プロフィール中において、シャープでツーンとする匂いのスパイシーな香気が石鹸のような香気よりも強い、請求項１９に記載の使用または方法、または請求項２０に記載の使用または方法。
請求項22
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる乳製品。
請求項23
ベークド製品の製造における、請求項１６に記載の使用。
請求項24
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドと、１つ以上の追加的酵素とを含んでなるベーキング酵素組成物。
請求項25
ＤＡＴＥＭと、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の脂肪分解活性を有する単離されたポリペプチドとを含んでなるベーキング組成物。
請求項26
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２４または２５に記載の組成物を生地成分の少なくとも１つに添加するステップを含んでなる、生地を調製する方法。
請求項27
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２４または２５に記載の組成物を含んでなる生地。
請求項28
改善された生地安定性を有する、請求項２７に記載の生地。
請求項29
生地の強度増大、安定性増大、弾性増大、粘性低下、および伸展性改善からなる群から選択される特性改善の少なくとも１つを有する、請求項２７〜２８のいずれか一項に記載の生地。
請求項30
請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の生地を焼くステップを含んでなる、ベークド製品を調製する方法。
請求項31
請求項３０に記載の方法によって得られるベークド製品。
請求項32
体積増大、風味改善、クラム構造改善、クラム柔らかさ改善、サクサク感改善、気泡形成低下、および老化防止改善からなる群から選択される、少なくとも１つの特質改善を有する、請求項３１に記載のベークド製品。
請求項33
製品が、積層生地から調製されるパン、ケーキまたはベークド製品である、請求項３２に記載のベークド製品。
請求項34
ケーキが、乳化剤非含有ケーキまたは卵低減ケーキである、請求項３３に記載のベークド製品。